摘要

創(chuàng)傷，腫瘤以及整形手術(shù)經(jīng)常會(huì)引起嚴(yán)重的骨缺損。自體骨移植材料受到供體的限制很難得到與骨缺損部位相匹配的外形，因此針對(duì)特定的骨缺損部位制備出個(gè)性化的骨支架材料具有重要意義。增材制造（3D打?。┘夹g(shù)是一種計(jì)算機(jī)輔助成型技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于能夠精準(zhǔn)、快速地實(shí)現(xiàn)支架宏觀外形與微觀結(jié)構(gòu)的精確構(gòu)建，并實(shí)現(xiàn)個(gè)性化的組織修復(fù)與再生。目前合成聚合物聚己內(nèi)酯（polycaprolactone, PCL）和天然高分子明膠（gelatin, Gel）已廣泛用于構(gòu)建骨支架，但由于明膠力學(xué)性能欠佳，在3D打印中常采用甲基丙烯?；拿髂z（GelMA）與PCL等混合來制備三維骨支架。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇冰乙酸作為溶劑，直接使用未改性的Gel與PCL和納米羥基磷灰石（nano-hydroxyapatite, n-HA）構(gòu)建了新型打印墨水（圖1）。這種墨水具有優(yōu)異的結(jié)構(gòu)保真度、結(jié)構(gòu)分辨率等打印適配性，通過3D打印易于制備出不同尺寸和結(jié)構(gòu)的三維骨支架，且支架表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性和細(xì)胞黏附性，以及優(yōu)異的體內(nèi)成骨性能。該研究結(jié)合了Gel，PCL和n-HA的不同特性，凸顯了各組分在骨組織工程支架中的優(yōu)勢(shì)，為臨床個(gè)性化骨缺損修復(fù)提供了一個(gè)有前景的3D打印策略和創(chuàng)新解決方案（論文一作王晨鑫 博士，通訊作者鄒琴 副研究員，李玉寶 教授）。

材料與方法

在這項(xiàng)研究中，研究者首先采用冰乙酸作為溶劑，分別溶解不同濃度的Gel和PCL。隨后將優(yōu)選的最適濃度的兩種溶液混合并加入n-HA攪拌均勻，得到了3D打印復(fù)合生物材料墨水，并對(duì)墨水的打印性進(jìn)行分析，篩選合適的打印條件。n-HA含量50% (w/w)，打印溫度10–15 °C，打印氣壓2.5 bar，打印速度7 mm/s，為Gel/PCL/n-HA 3D打印墨水的最佳打印條件（圖2）。

圖1 新型擠出式3D打印骨修復(fù)支架的制備

標(biāo)注文字：NH, Gel, NH, Pressure: 2.5 bar, NH, PCL, Nozzel diameters: 0.41mm, Print speed:7 mm/s, n-HA, Mixture, Biomaterial inks, 3D Printing, Cross-linking, Temperature, Gelatin, Temperature ↑, PCL, -80°C Freezing, GPHg0, GPH60, GPH45, Vanilin/C?H? OH, Bone repair, Osteogenesis

圖2 Gel/PCL/n-HA生物材料墨水的可打印性分析

(A) 不同濃度Gel/乙酸和PCL/乙酸的溶解情況；(B) 不同組分對(duì)墨水流動(dòng)性的影響，橙色虛線表示樣品瓶中材料上表面；(C) 不同n-HA含量對(duì)墨水打印性的影響，其中綠色、藍(lán)色和黃色表示不穩(wěn)定狀態(tài)，紅色表示穩(wěn)定狀態(tài)；(D) 打印速度和壓力的篩選，黃色虛線框表示最佳打印出絲狀態(tài)

Gel/PCL/n-HA 3D打印生物材料墨水可以打印出多種角度的曲線，并且出絲平滑、均勻，具有很高的保真度和優(yōu)異的自支撐性。之后通過Perfactory RP軟件設(shè)計(jì)了三種不同的二維打印路徑，通過擠出式3D打印技術(shù)逐層打印，獲得不同結(jié)構(gòu)的Gel/PCL/n-HA復(fù)合支架（GPH支架），分別命名為GPH45 (0°/45°/90°/135°)，GPH60 (0°/60°/120°)，GPH90 (0°/90°)（圖3）。

圖3 Gel/PCL/n-HA墨水的高保真3D打印結(jié)果

(A) 銳角、直角和鈍角的線性打印，藍(lán)色箭頭：拐角處的材料沉積；(B) 反“S”型設(shè)計(jì)，(B1) 3D Max中的3D設(shè)計(jì)圖，以及設(shè)計(jì)尺寸的表示，(B2-B4)照片顯示印刷反“S”圖案，黃色虛線：缺失部分，紅色虛線圈：材料沉積，(B5) 打印長絲的支撐穩(wěn)定性；(C) GPH45、GPH60、GPH90三種支架的最終形態(tài)

GPH支架展現(xiàn)出良好的三維多孔結(jié)構(gòu)，但在室溫空氣環(huán)境下會(huì)逐漸坍塌。將GPH支架分別在不同溫度下（4 °C，0 °C，-20 °C，-80 °C）冷凍12 h后取出，浸泡于去離子水中，發(fā)現(xiàn)支架坍塌。對(duì)不同溫度冷凍固化后的支架進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。交聯(lián)后，常溫下支架放入去離子水中，經(jīng)4 °C、0 °C和-20 °C冷凍的支架仍在水中坍塌，-80 °C冷凍交聯(lián)后的支架可保持長期的穩(wěn)定性。

圖4 GPH支架冷凍交聯(lián)示意圖

(a) 室溫下Gel分子鏈分布（RT：20-30 °C）；(b) Gel冷凍后的分子鏈；(c) 香蘭素交聯(lián)后Gel的分子鏈；①-④：不同交聯(lián)條件下GPH支架在水中浸泡后的狀態(tài)

結(jié)果

將GPH支架與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)，對(duì)GPH支架的細(xì)胞相容性進(jìn)行表征。SEM和CLSM結(jié)果均顯示細(xì)胞在支架表面黏附生長良好。TEM結(jié)果顯示，MG63細(xì)胞緊密黏附在支架表面，支架中的n-HA釋放后經(jīng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞中（圖5）。

圖5 GPH支架體外細(xì)胞相容性分析

(A1-A2) MG63細(xì)胞與支架共培養(yǎng)的SEM圖；(B1-B4) CLSM圖像，藍(lán)色：細(xì)胞核，綠色：線粒體，紅色：肌動(dòng)蛋白；(C1-C2) MG63細(xì)胞黏附和n-HA內(nèi)吞的TEM圖（M：支架材料，白色箭頭：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，黃色三角形：線粒體）

通過兔股骨滑車溝骨缺損模型，將三種不同結(jié)構(gòu)的支架植入缺損區(qū)域，觀察4周，8周和12周的骨再生和體內(nèi)支架降解情況。Micro-CT分析結(jié)果顯示，術(shù)后4周，新生骨組織僅在支架周圍形成薄層；8周時(shí)，新骨增多并且從支架外圍沿著支架向內(nèi)延伸；到第12周時(shí)，新生骨組織明顯增厚。支架隨著植入時(shí)間的延長，逐漸降解。降解過程中仍能較好保持三維多孔結(jié)構(gòu)（圖6）。

圖6 GPH支架降解及骨修復(fù)實(shí)驗(yàn)的Micro-CT結(jié)果

(A) 兔股骨滑車溝支架植入示意圖；(B) 股骨髁及缺損區(qū)域復(fù)合支架（黃色）的三維（3D）重建圖像；(C) 二維（2D）橫斷面圖像，紅色圓圈表示缺損區(qū)域；(D) 三維重建后的缺損區(qū)域骨再生（4、8、12 W）；(E) 缺損區(qū)域新生骨的可視化骨小梁厚度，其中紅色程度越高，骨小梁厚度越厚

H&E染色結(jié)果顯示，GPH支架具有良好生物相容性，植入體內(nèi)12周無炎癥反應(yīng)，并且可觀察到明顯的支架降解（圖7）。

圖7 GPH支架植入股骨髁后橫切面組織學(xué)分析

各組在4、8、12周的H&E染色結(jié)果。下圖是上圖藍(lán)色方塊的放大圖，黃色箭頭表示炎癥細(xì)胞，M為支架材料

此外，Masson染色結(jié)果顯示，GPH支架具有良好的成骨性能。12周時(shí)，在支架周圍形成了許多成熟的骨組織，并且大量膠原纖維通過支架孔隙沉積在缺損區(qū)域（圖8）。

圖8 三組GPH支架植入缺損后的Masson染色結(jié)果

各組在4、8、12周的Masson染色結(jié)果。下圖是上圖中黃色方塊的放大圖，綠色箭頭表示成骨細(xì)胞，NB表示新骨組織

結(jié)論與致謝

綜上所述，該研究開發(fā)了一種新型明膠基生物材料3D打印墨水。此墨水具有優(yōu)異的打印適配性（如結(jié)構(gòu)保真度，結(jié)構(gòu)分辨率等），同時(shí)實(shí)現(xiàn)了明膠在擠出式3D打印中的應(yīng)用。由此擠出式生物3D打印機(jī)制備得到的三維支架能有效促進(jìn)骨缺損愈合，在骨修復(fù)方面具有巨大潛力。

四川大學(xué)分析測(cè)試中心 博士生 王晨鑫 是該論文的第一作者，鄒琴 副研究員和李玉寶 教授為通訊作者。該研究得到了國家重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2021YFA1201300)、四川大學(xué)2021年度研究生教育創(chuàng)新與改革項(xiàng)目、分析測(cè)試中心分析測(cè)試技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目的資助。