一、研究背景

應(yīng)用于外周神經(jīng)系統(tǒng)的生物電子器件為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)提供了廣闊前景，可治療多種疾病，包括慢性偏頭痛、中風(fēng)、癲癇、抑郁癥、步態(tài)障礙、膀胱過度活動癥和高血壓等。這些通過外周神經(jīng)刺激的臨床治療，常是耐藥患者化學(xué)療法之外的唯一選擇，且技術(shù)仍在不斷發(fā)展。

然而，生物電子界面與外周神經(jīng)長期可靠性和整合的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于異物反應(yīng)（FBR），這是生物電子器件在體內(nèi)失效的主要原因。先天免疫細(xì)胞最初浸潤界面，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致富含細(xì)胞的異物反應(yīng)，包括巨噬細(xì)胞和多核巨細(xì)胞的形成。隨著時間推移，成纖維細(xì)胞活化導(dǎo)致植入生物電子器件與外周神經(jīng)界面處沉積富含膠原蛋白的纖維囊。慢性異物反應(yīng)使這些纖維囊增厚，顯著降低記錄和刺激過程中的界面電性能，最終影響生物電子器件的使用壽命。

為應(yīng)對異物反應(yīng)帶來的挑戰(zhàn)，已出現(xiàn)多種材料設(shè)計策略，包括超軟、親水、潤滑、藥物緩釋、兩性離子、生物分子共軛和機械驅(qū)動等特性。盡管這些努力旨在減輕纖維化，但由于異物反應(yīng)的發(fā)生在很大程度上與材料無關(guān)，以往的嘗試均未能成功完全阻止纖維化的發(fā)生。因此，開發(fā)一種能有效抑制纖維化、實現(xiàn)長期穩(wěn)定神經(jīng)調(diào)節(jié)的生物電子界面具有重要的臨床意義。

二、研究內(nèi)容

2.1 核心研究思路

研究提出，生物電子器件與外周神經(jīng)界面之間的強粘附性可完全防止纖維囊的形成。生物粘附水凝膠通過與外周神經(jīng)表面形成共價鍵，實現(xiàn)生物電子界面的共形接觸，從而抑制免疫細(xì)胞浸潤界面和后續(xù)纖維囊的形成。這種粘附性有助于外周神經(jīng)的電刺激或記錄，同時防止界面微動引起的機械驅(qū)動型異物反應(yīng)。

基于此，研究開發(fā)了一種粘附性非纖維化生物電子器件（ANB），旨在實現(xiàn)多樣化神經(jīng)上的可靠長期植入，且界面無纖維囊形成。該器件可包裹并粘附于體內(nèi)不同部位、不同尺寸的外周神經(jīng)，同時具備柔軟、靈活、可拉伸、粘附性和導(dǎo)電性等關(guān)鍵材料特性，以適應(yīng)生理環(huán)境中外周神經(jīng)的長期穩(wěn)定通信需求。

2.2 器件設(shè)計與制備

ANB采用生物相容性材料設(shè)計，用于基于粘附的多種外周神經(jīng)植入，主要包括三層結(jié)構(gòu)：

• 聚氨酯（PU）絕緣層
• 聚（3,4-乙烯二氧噻吩）-聚苯乙烯磺酸鹽（PEDOT:PSS）導(dǎo)電水凝膠
• 聚（乙烯醇）/聚（丙烯酸）（PVA/PAA）基生物粘附水凝膠

由于大鼠外周神經(jīng)尺寸較?。ㄖ睆?00至1200μm），研究采用多材料三維（3D）打印技術(shù)精確圖案化絕緣層和導(dǎo)電水凝膠，可在10分鐘內(nèi)快速、方便且精確地制造出分辨率為100μm的生物電子器件。

圖1 粘附性非纖維化生物電子器件（ANB）作為非纖維化界面策略的設(shè)計和機制。 (A) 生物電子器件治療疾病的臨床應(yīng)用示意圖； (B) 纖維囊形成對神經(jīng)造成限制的示意圖，活躍的異物反應(yīng)（FBR）導(dǎo)致嚴(yán)重纖維化并阻礙電傳遞，導(dǎo)致生物電子器件失效； (C) ANB利用生物粘附水凝膠建立非纖維化界面的機制，實現(xiàn)完整的電刺激； (D) 具有非纖維化界面的ANB圖像，ANB以牢固且緊密的方式植入腓總神經(jīng)（CPN）中分離出的腓深神經(jīng)（DPN）和腓淺神經(jīng)（SPN），ANB的生物粘附水凝膠與坐骨神經(jīng)（SN）形成共形接觸并防止纖維囊形成； (E) ANB制備和植入的示意圖：(1) 通過3D打印圖案化絕緣層和導(dǎo)電水凝膠；(2) 在生物電子器件上整合非纖維化粘附水凝膠并完全干燥；(3) 將ANB包裹在DPN周圍并在界面處按壓5秒以形成酰胺鍵和氫鍵； (F) ANB與生物組織接觸的界面韌性結(jié)果，每個實驗獨立重復(fù)（n=3），統(tǒng)計顯著性和P值通過雙側(cè)非配對t檢驗確定（NS表示無顯著性差異）。

生物粘附水凝膠膜通過先前建立的方案單獨制備，預(yù)拉伸以匹配其溶脹率，并在交聯(lián)后立即附著到3D打印的生物電子器件上，然后干燥。與外周神經(jīng)接觸時，干燥的生物粘附層吸收界面水分，形成氫鍵（物理交聯(lián)）和酰胺鍵（共價交聯(lián)）。這種基于N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）-胺共價偶聯(lián)的粘附機制已通過實驗驗證。

2.3 關(guān)鍵性能表征

2.3.1 機械性能

ANB表現(xiàn)出有利于長期植入的機械性能：

• 低楊氏模量（約0.75 MPa）
• 大最大拉伸率（>1000%）
• 高拉伸強度（約6.8 MPa）

與外周神經(jīng)直接接觸的生物粘附水凝膠層的楊氏模量（約0.1 MPa）與大鼠神經(jīng)外膜（約0.4±0.1 MPa）相當(dāng)，確保了與宿主組織的機械相容性。在20%應(yīng)變下經(jīng)過10,000次拉伸循環(huán)后，器件保持完整，各層之間無分層跡象，其高順應(yīng)性和可拉伸性適應(yīng)了外周神經(jīng)隨身體運動的自然活動，從而提高了其在體內(nèi)的長期穩(wěn)定性。

2.3.2 非纖維化界面驗證

為驗證ANB植入后4周粘附性生物電子界面是否保持非纖維化，研究通過蘇木精-伊紅（H&E）和馬松三色（MT）染色的組織學(xué)分析，在Sprague Dawley（SD）大鼠模型中檢查了外周神經(jīng)表面的纖維囊，比較了三組樣本：(i) 無植入物的天然組織；(ii) 附著ANB 4周的粘附界面；(iii) 非粘附界面（ANB先在無菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中完全溶脹以去除水凝膠的粘附特性，然后縫合在神經(jīng)上）。

研究考慮了大鼠全身不同尺寸（直徑300至1200μm）的外周神經(jīng)，包括枕神經(jīng)、迷走神經(jīng)、腓深神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)。組織學(xué)分析顯示，天然組織的神經(jīng)外膜周圍表面完整，粘附界面未觀察到可見的纖維囊形成，與所有考慮的神經(jīng)的天然組織組相當(dāng)；而所有非粘附界面在神經(jīng)外膜外側(cè)均表現(xiàn)出厚且富含細(xì)胞的纖維囊，包括脂肪組織壞死和隨后的疤痕組織形成。

圖2 非纖維化生物電子界面的驗證。 (A) ANB在多種外周神經(jīng)上植入4周，使用了枕神經(jīng)、迷走神經(jīng)、腓深神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)（CPNs），比例尺為1mm； (B至D) 生物電子器件植入4周前后外周神經(jīng)的代表性組織學(xué)圖像，比較三組：天然組織（B）、粘附界面（C）和非粘附界面（D），每條神經(jīng)均用H&E（左）和MT（右）染色，虛線表示神經(jīng)的外膜，比例尺為500μm； (E至G) 坐骨神經(jīng)的放大組織學(xué)圖像，聚焦于外膜周圍的界面，比較天然組織（E）、粘附界面（F）和非粘附界面（G），虛線表示外膜的邊界，比例尺為100μm； (H) 多種外周神經(jīng)外膜厚度的定量分析，箱線圖中，中心線表示平均值，須表示數(shù)據(jù)的第5和第95百分位數(shù)，每個實驗獨立重復(fù)（每組n=8），統(tǒng)計顯著性和P值通過雙側(cè)非配對t檢驗確定（NS表示無顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

2.3.3 電性能與穩(wěn)定性

ANB的電性能表現(xiàn)優(yōu)異，在1kHz時阻抗約為0.76千歐，導(dǎo)電率良好，電荷存儲容量（CSC）約為10.5 mC/cm2，電荷注入容量（CIC）約為290 μC/cm2。與鉑電極、純粘附劑和僅3D打印的生物電子器件（無生物粘附水凝膠）相比，盡管應(yīng)用生物粘附水凝膠略微降低了整體性能，但ANB仍表現(xiàn)出高質(zhì)量的刺激電性能，這是因為水凝膠提供了足夠的導(dǎo)電性，使電荷能夠從電極轉(zhuǎn)移到神經(jīng)，同時陰極和陽極之間的相對較大間距防止了串?dāng)_。

在循環(huán)電測試、機械測試和室溫PBS浸泡下的分析表明，ANB具有長期穩(wěn)定性：在100,000次充放電循環(huán)中，CSC增加了43%；在100,000次CIC循環(huán)中，CIC下降了18%，但仍足以在體內(nèi)刺激神經(jīng)；在10,000次拉伸循環(huán)（100%拉伸）和室溫PBS浸泡12周后，ANB的CSC和CIC保持穩(wěn)定或有所改善。

圖3 ANB與鉑電極、純粘附劑和生物電子器件的電性能和長期穩(wěn)定性比較。 (A) 不同頻率范圍內(nèi)的阻抗（上）和1kHz時的相應(yīng)阻抗（下）； (B) 電導(dǎo)率圖； (C) 電流密度作為施加電位的函數(shù)，帶有每種材料的抗腐蝕窗口，抗腐蝕窗口的細(xì)節(jié)在圖S14中解釋； (D) 根據(jù)從最大陽極電位（Ems）到最大陰極電位（Emc）的陰極雙相脈沖，電位輸入誘導(dǎo)的電流密度； (E) 分別從圖(C)和(D)得出的CSC（左軸）和CIC（右軸）的結(jié)果圖； (F) ANB的CSC與循環(huán)伏安法循環(huán)（上）和CIC與CIC循環(huán)（下）的關(guān)系，紅色虛線表示第一個循環(huán)的初始值，阻抗、電導(dǎo)率、CSC和CIC的值表示平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（n=3；獨立樣本）； (G) 阻抗（左）、CSC（中）和CIC（右）的圖，歸一化為第一個拉伸循環(huán)的初始值，作為100%拉伸下拉伸循環(huán)的函數(shù)； (H) 阻抗（左）、CSC（中）和CIC（右）的圖，歸一化為浸泡在PBS溶液中之前的初始值，作為在PBS溶液中浸泡時間的函數(shù)，紅色虛線表示第一個拉伸循環(huán)和浸泡在PBS溶液中之前的初始值，阻抗、CSC和CIC的值表示平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（n≥5；獨立樣本）。

2.4 體內(nèi)長期血壓調(diào)控實驗

為評估生物電子器件中非纖維化界面的功效和重要性，研究使用ANB或非粘附器件刺激腓深神經(jīng)（DPN）4周，通過無創(chuàng)尾袖法每周監(jiān)測自發(fā)性高血壓大鼠的血壓（BP）和心率（HR）。選擇血壓調(diào)控作為主要功能讀數(shù)，因為它是DPN傳導(dǎo)的靈敏整體測量指標(biāo)，即使是輕微的傳導(dǎo)缺陷也會削弱這種全身反應(yīng)，使血壓成為比局部神經(jīng)電圖記錄更具轉(zhuǎn)化相關(guān)性的指標(biāo)。

研究通過改變電流脈沖的幅度（0.1至1.0 mA）、寬度（100至1000 μs）和數(shù)量（N=1至200個脈沖），確定了最佳刺激參數(shù)：0.2 mA、100 μs和N=50個脈沖。使用該參數(shù)刺激時，自發(fā)性高血壓大鼠的血壓可降至正常大鼠水平，并在刺激結(jié)束后維持40分鐘以上，且心率保持在約400次/分鐘，未出現(xiàn)傳統(tǒng)方法中常見的心率下降副作用。

長期刺激實驗表明，ANB在4周的刺激后仍能實現(xiàn)血壓調(diào)控，達(dá)到與正常大鼠相似的水平，各時間點血壓下降幅度穩(wěn)定在33%-37%；而非粘附器件僅在植入后立即能夠調(diào)控血壓，1周后刺激效果顯著下降，4周時血壓下降幅度僅為2%。

圖4 生物電子器件的粘附界面和非粘附界面在DPN刺激下的血壓調(diào)控和心率變化比較。 (A) 在自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）中使用ANB或非粘附器件進(jìn)行DPN刺激時，BP和HR測量配置的示意圖，比例尺為1mm，W表示周； (B) 比較SHR和正常大鼠在無DPN刺激時的BP和HR圖； (C至E) SHR在DPN刺激期間的BP調(diào)控特征，三組分別為：電流脈沖幅度變化（0.1至1.0 mA；C）、脈沖寬度變化（100至1000 μs；D）和脈沖數(shù)量變化（1至200個脈沖；E），DPN刺激的標(biāo)準(zhǔn)電流脈沖使用0.2 mA的幅度、100 μs的脈沖寬度和N=1個脈沖，綠點表示使用不同電流脈沖的刺激時間，圖中顯示連續(xù)BP（上）和HR（下）； (F) 根據(jù)不同電流脈沖的DPN刺激，相應(yīng)BP（紅條；左軸）和HR（藍(lán)條；右軸）的圖，以表征BP調(diào)控； (G) 4周內(nèi)長期DPN刺激期間測量的連續(xù)BP圖，電流脈沖（0.2 mA、100 μs和N=50個脈沖）以0.2 Hz的間隔施加10分鐘，由具有粘附界面的ANB（紅線；上）和具有非粘附界面的縫合器件（藍(lán)線；下）施加，綠色虛線表示正常大鼠的BP范圍（76至85 mmHg），(B)、(F)和(G)中的值表示平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，每個實驗獨立重復(fù)（n=3）。

2.5 神經(jīng)刺激后的免疫熒光分析

為進(jìn)一步驗證粘附性生物電子界面的長期抗纖維化性能，研究對每周刺激一次、植入12周后收集的DPN樣本進(jìn)行了免疫熒光分析，比較了天然組織、ANB和非粘附器件三組樣本。結(jié)果顯示：

• 非粘附界面的神經(jīng)絲密度比天然組織降低了28%，神經(jīng)束收縮，表明功能喪失和持續(xù)炎癥；
• 非粘附植入物的神經(jīng)內(nèi)觀察到顯著的巨噬細(xì)胞（CD68）浸潤，比天然組織增加了45%；
• 非粘附器件周圍的血管生成更強，整個神經(jīng)外膜和纖維囊的血管密度比天然組織高56%（α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA））；
• 非粘附界面的神經(jīng)外膜和纖維囊中有大量I型膠原蛋白（Col-I）沉積，導(dǎo)致外膜顯著增厚，達(dá)到粘附界面厚度的三倍以上；
• 植入ANB的DPN表現(xiàn)出與天然組織相當(dāng)?shù)纳窠?jīng)絲密度，在所有評估指標(biāo)上都與天然組織非常相似，未觀察到神經(jīng)和粘附界面中的巨噬細(xì)胞浸潤，神經(jīng)周圍沒有可檢測到的成纖維細(xì)胞活性或纖維化膠原蛋白沉積。

圖5 DPN神經(jīng)刺激后的免疫熒光圖像。 (A至C) 比較天然組織（A）、ANB植入12周后的粘附界面（B）和非粘附器件植入12周后的非粘附界面（C）中的神經(jīng)絲（NF；綠色）、巨噬細(xì)胞（CD68；紅色）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA；紅色）、I型膠原蛋白（Col-I；紅色）和細(xì)胞核[4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；藍(lán)色]，NF、CD68、α-SMA、Col-I和DAPI分別代表神經(jīng)束、巨噬細(xì)胞、血管、膠原蛋白和細(xì)胞核的標(biāo)志物，虛線和箭頭表示天然組織和非粘附界面的外膜區(qū)域以及粘附界面的外膜-ANB區(qū)域，在非粘附界面觀察到纖維囊，比例尺為200μm； (D至F) 免疫熒光結(jié)果的定量分析，比較天然組織（黑色）、粘附界面（紅色）和非粘附界面（藍(lán)色）中每1000μm2的NF數(shù)量（D）、巨噬細(xì)胞數(shù)量（E）、血管數(shù)量（G）和膠原蛋白總面積（F），每個實驗獨立重復(fù)（每組n≥3），統(tǒng)計顯著性和P值通過雙側(cè)非配對t檢驗確定（NS表示無顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01）。

三、研究結(jié)論

1. 研究開發(fā)的粘附性非纖維化生物電子器件（ANB）通過生物粘附水凝膠與外周神經(jīng)形成強共價鍵連接，成功抑制了免疫細(xì)胞浸潤和纖維囊形成，在多種外周神經(jīng)（枕神經(jīng)、迷走神經(jīng)、腓深神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)）上實現(xiàn)了長達(dá)12周的非纖維化界面穩(wěn)定存在。
2. ANB具有優(yōu)異的機械性能（低模量、高拉伸性、良好的機械相容性）和電性能（低阻抗、高電荷存儲和注入容量），且在長期體內(nèi)環(huán)境中保持穩(wěn)定，經(jīng)過10,000次拉伸循環(huán)和12周浸泡后仍能維持良好的性能。
3. 在自發(fā)性高血壓大鼠模型中，ANB通過對腓深神經(jīng)的長期穩(wěn)定刺激（長達(dá)4周），實現(xiàn)了有效的血壓調(diào)控，血壓下降幅度穩(wěn)定在33%-37%，且未出現(xiàn)傳統(tǒng)方法中常見的心率下降副作用；而非粘附器件的刺激性能在1周后顯著下降，4周時幾乎完全失效。
4. 免疫熒光分析證實，ANB界面在12周后仍保持與天然神經(jīng)組織相似的神經(jīng)絲密度，無明顯巨噬細(xì)胞浸潤、血管異常增生和成纖維細(xì)胞活化，而非粘附界面則出現(xiàn)明顯的纖維化特征。
5. 該研究提出的基于粘附的策略為解決生物電子器件與外周神經(jīng)界面的纖維化問題提供了新的有效途徑，ANB器件展現(xiàn)出巨大的臨床轉(zhuǎn)化潛力，可用于長期、非纖維化的器件整合，為基于生物電子學(xué)的疾病治療、康復(fù)和人體增強開辟了新的方向。

四、論文信息