A：ACFs復合3D打印支架（PS/ACFs）的制造流程：通過3D打印結合定向冷凍鑄造技術將ACFs嵌入3D打印支架，實現(xiàn)細胞募集與組織趨向性（紅色箭頭示細胞募集，橙色箭頭示ACFs在顱骨缺損中的作用）；

B：KP肽（骨形態(tài)發(fā)生蛋白2模擬肽）與QK肽（血管內(nèi)皮生長因子模擬肽）功能化的PS/ACFs支架促進大鼠臨界尺寸顱骨缺損修復的機制（藍色箭頭示新生膠原纖維方向，綠色箭頭示骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的成骨分化）；

注：Gel-MA為甲基丙烯?；髂z，PS為3D打印支架，BMSC為骨髓間充質(zhì)干細胞。

A：通過3D打印結合冷凍鑄造制備ACFs復合3D打印支架的流程示意圖（UV為紫外光）；

B：PS與PS/ACFs凍干前后的宏觀外觀（凍干后PS/ACFs孔洞內(nèi)填充白色纖維）；

C：PS與PS/ACFs的掃描電鏡（SEM）圖（俯視圖與橫截面），可見PS/ACFs孔洞內(nèi)充滿垂直定向纖維，PS無纖維填充；

D：ACFs的偽彩色圖（示纖維取向角度分布）；

E：ACFs的取向角度分布（中位角度近90°，呈高度垂直定向）；

F：ACFs的直徑分布（1-5μm，均值2.46±0.86μm）；

注：Oct為最佳切割溫度化合物。

A：（i）PS、PS/RCFs、PS/ACFs的體外細胞接種與黏附示意圖；（ii）大鼠皮下植入模型評估PS/ACFs的體內(nèi)細胞募集與組織長入示意圖；

B-C：共聚焦顯微鏡3D圖像與SEM圖（人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）接種24小時后）：PS僅表面黏附細胞（深度＜200μm），PS/RCFs細胞遷移至300μm深度，PS/ACFs細胞遷移至600μm深度，且細胞優(yōu)先附著于纖維區(qū)域；

D：CCK-8檢測（24小時）：PS/ACFs與PS/RCFs的細胞黏附量為PS的2倍；

E-G：蘇木精-伊紅（H&E）染色與半定量分析（皮下植入1、2周）：PS/ACFs的Gel-MA晶格間隙內(nèi)浸潤細胞更多，ACFs區(qū)域新生組織密度顯著高于PS的空白區(qū)域，且無纖維囊形成；

H-I：三色染色（2周）：PS組新生細胞外基質(zhì)（ECM）纖維隨機排列，PS/ACFs組呈有序排列（與ACFs方向一致），偽彩色圖與角度定量驗證PS/ACFs組膠原纖維取向一致性更高；

注：*P<0.001，****P<0.0001，ns為無顯著性差異。

A：PS-KP的制備流程與裸鼠皮下異位成骨模型驗證示意圖（n=5）；

B：Micro-CT 3D重建圖（4周）：PS-KP500組（500μg/ml KP肽）可見明顯新生骨，PS、PS-KP250（250μg/ml）、PS-KP750（750μg/ml）組幾乎無新生骨；

C：Micro-CT軸位、矢狀位與冠狀位圖像：PS-KP500組新生骨呈與支架一致的晶格形態(tài)；

D-G：定量分析（4周）：PS-KP500組的骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨表面積分數(shù)（BS/TS）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）顯著高于其他組；

H：三色染色（4周）：PS-KP500組類骨質(zhì)基質(zhì)呈團塊狀分布，其他組僅少量或無類骨質(zhì)；

I-J：骨橋蛋白（OPN）免疫組化染色與半定量：PS-KP500組OPN表達最高，顯著高于PS-KP750組；

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，IOD為積分光密度。

A：PS/ACFs-QK的制備流程與大鼠皮下植入模型評估示意圖（n=4）；

B：三色染色（2周）：新生血管數(shù)量隨QK肽濃度（100-500μg/ml）增加而增多；

C：新生血管數(shù)量定量：PS/ACFs-QK500組（500μg/ml）顯著高于其他組；

D-E：CD31免疫組化染色與血管面積定量：PS/ACFs-QK300（300μg/ml）與QK500組新生血管面積高于PS與QK100組，且QK500組高于QK300組；

注：*P<0.05，***P<0.001，ns為無顯著性差異。

A：實驗支架（PS-KP500/ACFs-QK500）與膠原海綿（陽性對照）植入大鼠8mm直徑臨界尺寸顱骨缺損的示意圖（n=5）；

B：X線原始圖像（4、8周）：PS-KP500/ACFs-QK500與膠原海綿組的缺損區(qū)域新生骨多于對照組；

C-D：Micro-CT 3D重建圖與冠狀位圖像（4、8周）：PS-KP500/ACFs-QK500組8周時新生骨體積與分布更優(yōu)；

E-F：定量分析（4、8周）：4周時兩組骨體積分數(shù)（BV/TV）與表面覆蓋率無顯著差異；8周時PS-KP500/ACFs-QK500組顯著高于膠原海綿組；

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns為無顯著性差異。

A-B：H&E與三色染色（n=5）：PS-KP500/ACFs-QK500與膠原海綿組缺損區(qū)域可見更多新生骨（NB）有機基質(zhì)，對照組極少；PS-KP500/ACFs-QK500組檢測到垂直定向膠原纖維（由ACFs引導），且纖維內(nèi)形成脫鈣有機骨基質(zhì)；

C-F：缺損邊緣與中心區(qū)域新生軟組織的三色染色與角度分布：對照組與膠原海綿組膠原組織水平排列，PS-KP500/ACFs-QK500組呈垂直排列；

注：NB為新生骨，C為膠原海綿，PS為3D打印支架。

A-B：H&E與三色染色（n=5）：8周時PS-KP500/ACFs-QK500組缺損區(qū)域新生有機骨基質(zhì)最多，且支架區(qū)域（PS）被新生骨包裹；

C：免疫組化染色（CD31、OCN、OPN、RUNX2）：PS-KP500/ACFs-QK500組的血管標志物（CD31）與成骨標志物（OCN、OPN、RUNX2）表達最高；

D-G：積分光密度定量：PS-KP500/ACFs-QK500組的CD31、OCN、OPN、RUNX2相對表達量顯著高于膠原海綿與對照組；

注：*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，RUNX2為 Runt相關轉錄因子2（成骨關鍵轉錄因子）。